При обнаружении спиралевидного образования дифференциальный диагноз практически приходится проводить между бледной трепонемой и трепонемой рефрингенс, которая встречается на половых органах. Морфологическое различие их заключается в том, что трепонема рефрингенс часто имеет всего 5—7 грубых завитков. Она короткая, толстая, обладает беспорядочными движениями. В то же время трепонема рефрингенс имеет более яркое со слегка золотистым оттенком свечение в отличие от серебристого свечения бледных трепонем.

От зубной трепонемы, которая довольно часто обнаруживается в полости рта, бледная трепонема отличается большим количеством завитков и более пологой их формой.

Нужно иметь в виду, что когда к тканевой жидкости, полученной для исследования, примешано значительное количество крови, образовавшиеся нити фибрина могут быть похожи на бледные трепонемы. Нити фибрина — длинные с крупными завитками образования, тонкие, неравномерные по толщине. Иногда они могут имитировать самостоятельные движения.

Исследование бледной трепонемы в живом состоянии методом микроскопического изучения материала в темном поле по простоте выполнения, скорости исследования и получения соответствующих результатов в настоящее время является главным методом обнаружения бледных трепонем в тканевой жидкости высыпных элементов, подозрительных на сифилиды. Исследование на бледную трепонему в темном поле зрения является основным лабораторным тестом при установлении диагноза первичного серонегативного сифилиса.

Однако в тех случаях, когда по какимлибо причинам пользоваться методом исследования материала в темном поле зрения невозможно, применяют метод исследования на бледную трепонему в окрашенных препаратах.