Этиология коклюша
В жидких средах коклюшный микроб растет при обязательном добавлении к ним крахмала (0,15%). Взамен крахмала предложен активированный уголь, но он менее пригоден. Основой жидких сред служит казеиновый гидролизат, который содержит достаточно аминокислот для роста коклюшного микроба. Коклюшный микроб утилизирует глутаминовую и аспарагиновую аминокислоты, серии, треонин, глицин, аланин и пролин. Скорость утилизации аминокислот у вирулентных культур больше, чем у авирулентпых. Взбалтывание и аэрация задерживают рост вирулентных и стимулируют рост авирулентных штаммов.
Углекислота в атмосфере способствует росту при концентрации от 0,3 до 10%. При более высокой концентрации она задерживает рост коклюшных культур. Уровень рН среды должен быть в пределах 7,6—7,8. Условия газообразования требуют определенных соотношений между поверхностью и объемом: среда разливается тонким слоем (около 1 см). Посев в жидкую среду производится густой бактериальной взвесью: на 100 мл среды Коена и Уилера требуется засеять 0,2 мл взвеси микробов, содержащей 2000 млрд. микробных тел в 1 мл по коклюшному стандарту. Засеянная среда содержит 4 млрд. микробных тел в 1 мл. Рост микробов обнаруживается через 2—3 дня. Определение количества микробов по стандарту затруднительно вследствие слабой мутности самой среды. Вирулентный штамм дает поверхностную пленку. Биохимическая активность коклюшной палочки в жидких средах не проявляется, Сахаров микроб не разлагает, индол не образует.
Из факторов микробной клетки, обусловливающих ответные реакции организма, наиболее изученными являются следующие: антиген (агглютиноген), токсин и гемагглютинин. Наличие этих трех антигенов является признаком (гладкого) вирулентного штамма.
Агглютиноген, расположенный на поверхности микробной клетки, стимулирует развитие агглютининов в организме хозяина и обусловливает свойство культуры специфически агглютинироваться иммунной коклюшной сывороткой. Но агглютинабильность культур и содержание в них агглютиногена изменяются независимо друг от друга. То же относится к способности культур адсорбировать агглютины из иммунной сыворотки. В антигенном отношении коклюшные микробы, как показали В. И. Иоффе и Д. М. Хай, однотипны: свежевыделенные штаммы серологически гомологичны.
В теле микроба агглютиноген находится вместе с токсином и гемагглютинином. Для выделения его в свободном состоянии применяется ряд методов. Флосдорф с соавторами сонической (ультразвуковой) обработкой густой взвеси коклюшных микробов получил экстракт, содержащий, кроме агглютиногена, также токсин и гемагглютинин. Последующими осаждениями, диализом и другими приемами был получен агглютиноген в очищенном состоянии. Этот способ дает наиболее полное извлечение агглютиногена. В соническом экстракте получается половина агглютиногена, содержавшегося в бактериальной массе до ее обработки. В 1 мл содержится 700—800 единиц агглютиногена.
Смолене и Мад кислотной обработкой бактерийной взвеси с последующими подщелачиванием, осаждением сульфатом аммония и диализом получили агглютиноген с содержанием 600—700 единиц в 1 мл. Парфентьев с соавторами экстрапировал и агглютиноген из обезвоженной и освобожденной от липоидов бактериальной массы с последующими фильтрованием через свечу Беркефельда, осаждением сульфатом аммония и диализом. Хинк и Джонсон получили агглютиноген обработкой культуры 2,5 молярным раствором мочевины. Их препарат содержит 500 единиц агглютиногена в 1 мг. Б, Л. Палант выделила антиген методом Буавена. Е. Ф. Трушина-Туманова и Е. А. Мамаева путем триптического переваривания бактериальной массы с последующим осаждением перевара 68% спиртом получили антиген коклюшной культуры.
А. В. Машков и 3. М. Михайлова экстрагировали взвесь коклюшных микробов эфиром с последующим фильтрованием экстракта через мембранный фильтр и получили в фильтрате растворенный антиген коклюшного микроба. Описанными способами достигалась достаточно высокая очистка препарата, что видно из резкого снижения токсичности. Очищенный агглютиноген в 1000 раз менее токсичен, чем сонический экстракт из бактерий. В 5% растворе агглютиноген не токсичен для мышей, в то время как исходный экстракт культуры вызывал гибель мышей в дозах от 0,02 до 0,05 мл. Кролики переносят внутривенное введение 4000 единиц агглютиногена. Агглютиноген устойчив в кислой среде. Это способствует освобождению его от токсина. При рН 3—4,5 он остается в растворе, из которого осаждается 68% спиртом. Очищенный агглютиноген обладает белковой природой.
Нативный экстракт при внутривенном введении вызывает у кроликов образование агглютининов в высоком титре, а именно до 1:3200—6400 (культура — в титре 1: 6000— 12 000—25 000). С антимикробной сывороткой агглютиноген дает реакцию прецепитации и реакцию связывания комплемента и обладает способностью адсорбировать из нее антитела (агглютинины). Последнее свойство используется для количественного определения агглютиногена в растворах.
Следовательно, коклюшный агглютиноген является полным антигеном: он стимулирует образование антител при парентеральном введении и вступает с ними в серологические реакции. При внутрикожном введении агглютиноген вызывает кожную аллергическую реакцию у больных и привитых. Таким образом, он обладает аллергенными свойствами.
Токсин коклюшного микроба выделяется в окружающую питательную среду, а также освобождается при разрушении микробной клетки. Определение его производится по смертельному действию при внутривенном или внутрибрюшинном введении белым мышам и по дермонекротической реакции при внутрикожном введении кроликам-альбиносам. Кожная реакция у людей и животных продолжается неделю и больше и может сопровождаться некрозом. Токсин в жидкой культуре поступает в окружающую питательную среду, в которой он обнаруживается лабораторными методами после второго дня инкубации, но максимального количества достигает через 6—12 дней. Смертельная доза токсина для белых мышей равняется 0,025 мл.
Из бактериальной культуры токсин может быть выделен путем ее разрушения (ультразвуком, повторными замораживаниями и оттаиваниями). При первом способе получается наиболее сильный токсин: в 1 мл ультразвукового экстракта, полученного из бактерийной взвеси 1000 миллиардов микробных тел в 1 мл, содержится до 1000 мышиных LD50, в то время как в 1 мл экстракта, полученного повторными замораживаниями и оттаиваниями взвеси той же концентрации, содержится всего 50 LD50. Но длительная ультразвуковая обработка (больше одного часа) разрушает токсин. При хранении токсин разрушается, однако добавление 50% глицерина или 50% сахарозы сохраняет полностью его активность в течение 17 месяцев. Токсин по устойчивости к нагреванию делится на термолабильный, который инактивируется при температуре 56 в течение 30 минут, и термостабильный, выдерживающий нагревание до 100° в течение 5 минут. Только термолабильный токсин вызывает некроз кожи; 1 мг его при внутривенном введении может убить кролика.
Он осаждается без заметной потери активности при рН 4,4—4,5. Формалин переводит токсин в анатоксин, который вызывает у кроликов образование антитоксина, достигающего 200 единиц АЕ в 1 мл крови. Живая культура стимулирует образование у них антитоксина в титре 20—40 единиц АЕ в 1 мл крови. В организме больного человека антигенность коклюшного токсина слабо выражена. В крови больных коклюшем и реконвалесцентов коклюшный антитоксин совсем не обнаруживается или определяется в незначительных количествах (0,3 АЕ в 1 мл).
Роль токсина коклюшной палочки при заболевании не ясна. Есть указание на то, что он способствует внедрению микроба в ткани организма. Возможно, имеет значение также способность токсина сенсибилизировать и вызывать анафилактическую реакцию, что было отмечено при повторных его введениях. Некоторые исследователи придают значение токсину в развитии иммунитета. Но большинство авторов считает, что сам по себе антитоксический иммунитет неспособен защитить против коклюшного микроба и, следовательно, иммунизация одним анатоксином недостаточна для защиты детей против коклюша.
Гемагглютинин обнаруживается у большинства свежевыделенных коклюшных культур. Он вызывает агглютинацию эритроцитов человека, мышей и кур в разведениях от 1: 89 до 1: 196. Авирулентные культуры не обладают этим свойством, но у вирулентных штаммов строгого соотношения между уровнем показателя гемагглютинина и степенью вирулентности не наблюдается. В жидких культурах он поступает в питательную среду, а из культур на плотных питательных средах его можно извлечь раствором хлористого или уксуснокислого натрия. Гемагглютинин не стоек.
Он быстро разрушается при хранении без консерванта (50% глицерин), при нагревании до 60°. Активность его резко ослабевает под воздействием фенола и формалина в 0,5% концентрации и мертиолята в разведении 1:10 000. Авторы, открывшие гемагглютинин. Авторы, открывшие гемагглютинин, связывали с ним «защитные» свойства культуры, т. е. способные стимулировать защитные реакции организма. Но последующие исследования других авторов не подтвердили это предположение. Спонтанный осадок ультразвукового экстракта коклюшной культуры содержал гемагглютинин, но не обладал «защитным» действием. Тот же экстракт, освобожденный от гемагглютинина путем насыщения его эритроцитами, содержал агглютиноген в исходном титре. Кроме того, было показано, что 48-часовые культуры не содержали гемагглютинина, но обладали защитными свойствами. Роль гемагглютинина в инфекционном процессе остается неясной.
Большой интерес представляют работы о «защитном антигене» возбудителя этой инфекции. Аналогичного характера антиген получен из культуры сибиреязвенной палочки. Этот антиген вызывает у иммунизированных животных устойчивость к вирулентным штаммам сибиреязвенной палочки, но с антителами, гомологичными обоим антигенам микроба (капсульный и соматический), в реакцию не вступает.
«Защитный антиген» коклюшного микроба был обнаружен и испытан в опытах на мышах. По данным этих исследователей, «защитный антиген» коклюшного микроба не связан ни с агглютиногеном, ни с токсином, ни с гемагглютинином. Он не стимулирует образование агглютининов в организме животных и не адсорбирует агглютинины из антимикробной сыворотки. По защитным свойствам он не только не уступает, но даже превосходит корпускулярную вакцину. В опытах на животных он оказался безвредным и нетоксичным. При фильтровании через бактерийные фильтры его защитная активность ослабевает. Авторы считают, что «защитный антиген» представляет собой продукт метаболизма микроба, а не часть клетки, освобождающуюся при ее разрушении. Для получения «защитного антигена» необходимы определенные условия питательной среды и сроки инкубации, а также условия содержания штамма, обеспечивающие сохранение его в первой фазе.
Работы по изучению «защитного антигена» коклюшной палочки представляют большой теоретический интерес. Надо полагать, что они весьма перспективны в отношении усовершенствования специфической профилактики коклюша. В настоящее же время вопросы о механизмах защиты иммунного организма и о факторах микробной клетки, стимулирующих развитие указанных механизмов в течение инфекционного процесса, не разрешены. Однако это не оказалось непреодолимым препятствием в разработке специфической профилактики коклюша.
